了解SARS-COV-2 S蛋白的结构

糖基化是由碳水化合物共价连接totarget大分子,通常是蛋白质的过程。这种修改提供各种功能,包括引导蛋白质折叠(1,2),促进蛋白质稳定性(2),并参与信号功能(3)。

SARS-CoV的-2蛋白的带状结构
SARS-CoV-2尖峰蛋白的带状结构

SARS-CoV-2利用从病毒表面突出的广泛糖基化的spike (S)蛋白与血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合介导宿主细胞进入。疫苗的开发一直集中在这种蛋白质上,它是体液免疫反应的焦点。了解SARS-CoV-2病毒spike (S)蛋白的多糖结构对于开发基于糖蛋白的候选疫苗至关重要。

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回首:无细胞表达系统有助于在缺氧反应涉及特征分析蛋白质

HIF-1a-pVHL-ElonginB-ElonginC复合体的结构
一个HIF-1α-VHL蛋白-ElonginB-ElonginC复杂的结构

威廉·g·凯林,彼得·j·拉特克利夫爵士和格雷戈·l·赛门扎被授予诺贝尔奖2019年诺贝尔生理学或医学奖他们的细胞如何感知和适应氧气供应发现。

Kaelin和Ratcliffe的实验室致力于研究转录因子HIF(低氧诱导因子)。这一转录因子是关键的细胞适应变化的氧气供应。

当氧气水平升高的细胞含有非常少的HIF。泛素被添加到经由VHL复合物中的蛋白HIF并且其在蛋白酶体中降解。当氧气水平低(缺氧)的HIF的量增加。

在2001年这两个群体发表的文章表征VHL和HIF之间的相互作用,以及这些文章是由诺贝尔奖组织中引用它们的新闻稿今年的奖项。(1,2)。这两项研究都表明,脯氨酸的正常氧条件下的羟基化残基P564启用VHL识别和结合到HIF。

使用无细胞表达的(即,TNT偶联的转录/翻译系统)由两个实验室是在VHL的表征键:HIF相互作用的实验室使用HIF和VHL35由TNT系统在正常或低氧工作状态下产生的-S标记蛋白:

  • 测定氯化亚铁和氯化钴对相互作用的影响
  • 映射到发生所需的相互作用HIF的特定区域(556-574)
  • 确定HIF点突变对相互作用的影响
  • 使用合成肽阻断相互作用
  • 得出结论,对于要发生的相互作用在哺乳动物细胞中的一个因素是必要的。

文献引用

  1. 伊凡,M。(2001)HIF通过脯氨酸羟基化针对VHL介导的破坏:对Ø2传感科学292:464-67。
  2. Jaakkola,P.et al。(2001年)靶向HIF-定向于复合物的von Hippel-Lindau泛素化2-调节的丙基羟基化作用科学202,468-72。

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描述化合物在无细胞系统中的结合

二恶英(例如,2,3,7,8-四氯代p-二恶英(TCDD)及相关化合物(DRCs)是通过食物链逐渐积累的持久性环境污染物,主要在动物的脂肪组织中。二恶英是剧毒的,会导致生殖和发育问题,破坏免疫系统,干扰激素,还会导致癌症。DRCs广泛的毒性和生物学效应主要是由芳基烃受体(AHR)介导的。

在动物细胞中,DRC的结合AHR在细胞质中,然后易位到核中,在那里它们影响多个靶基因,包括异源物质代谢酶,如CYP1A同工酶的转录。AHR也参与免疫系统的维护,蛋白质降解和细胞增殖。

丛林乌鸦(乌鸦macrorhynchos)已被认为是监测环境化学品(如耐药化学品)的适当指标。哺乳动物只有一种AHR形式,鸟类有多种AHR亚型,如AHR1和AHR2。为了揭示多种鸟类AHR亚型在对DRCs反应方面的功能多样性,Kim最近进行了一项研究。调查丛林乌鸦AHR同种型的分子和功能特征,cAHR1和JCAHR2(1)。

cAHR1和JCAHR2蛋白合成用AHR肌钙蛋白快速耦合网织红细胞裂解系统来检查这些JCAHRs有可能与TCDD结合。tcdd结合亲和力的in vitro表达jcAHR蛋白用蔗糖梯度的速度沉降法进行分析。

结果表明,这两种JCAHR1andJCAHR2是能够结合TCDD。

参考
Kim ey (2019)芳基烃受体2可能介导丛林乌鸦细胞色素P450 1A的诱导(乌鸦macrorhynchos)。生态毒理学和环境安全171。99 - 111

突变分析使用HaloTag融合蛋白

在最近的一篇文献中,Kinoshita和他的同事利用磷酸亲和电泳技术,即磷酸标记十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(磷酸标记SDS-PAGE;1).他们发现在典型的人类细胞中组成了多种磷酸化状态不同的MEK1变种。

为了研究激酶活性与药物疗效的关系,同一试验组的研究人员使用磷酸化标记SDS- PAGE对多种MEK1突变体进行了磷酸化profling(2)。

他们引入了MEK-1编码基因的突变,而MEK-1编码基因与自发性黑色素瘤、肺癌、胃癌、结肠癌和卵巢癌相关Flexi HaloTag克隆pFN21AE0668,这是适合于在哺乳动物细胞中的N-末端HaloTag融合MEK1的表达。继续阅读“突变分析使用HaloTag融合蛋白”

自下而上蛋白质组学的压力循环样品制备优化

大规模的蛋白质组分析已经揭示了蛋白质组对疾病的反应变化,如果蛋白质组分析能被带入临床实验室,这些变化为复杂疾病的诊断和治疗带来了巨大的希望。成功和可靠的大规模蛋白质组学要求样品制备工作流程是可重复的,可靠的和几乎没有变化。为了将蛋白质组学引入临床实验室,样品准备和分析的标准化程序和工作流程需要在对临床有用的时间尺度上产生有效的、可操作的结果。

临床蛋白质组学分析最常见的两种类型的样品是体液和组织活检。为了处理这些类型的样品中,有两个初始步骤:组织增溶,随后通过蛋白水解消化。固体组织的溶解是最劳动密集和产生最可变的结果。

使用Barocycler仪器引入压力循环技术(PCT)的大大改善了组织增溶和消化的一致性。基于PCT-样品制备协议一般利用尿素作为蛋白质变性和增溶裂解缓冲液。尿素具有若干缺点,包括抑制胰蛋白酶活性,并引入等氨甲酰不需要的修饰。

卢卡斯和他的同事们分析用SDC代替尿素是否能产生类似的组织消化谱,并改进PCT方法。

与尿素相比,SDC允许使用更高的温度,因此第一步(裂解、还原和烷基化)在56℃进行。优化了Barocycler中的第二消化步骤,淘汰了第三消化步骤。为了进一步缩短消化时间,它们利用了快速胰蛋白酶/酶Lys-C。快速胰蛋白酶/酶Lys-C保持健壮的活性在70℃,并在单个步骤中进行允许Barocycler消化,在30个循环(约30分钟),而不是105分钟完成消化,简化的协议。

该数据提出了一种改进的传统组织PCT方法,在Barocycler中使用SDC、n -丙醇取代尿素和蛋白水解酶,以及具有更高最佳温度的改良商业可用酶。

论文引用

卢卡斯,N。等人。(2019)加速Barocycler裂解和提取样品制备通过质谱临床蛋白质组学蛋白质组的J18, 399 - 405。

抗药性的理解的机制噻虫嗪在棉蚜

A.棉叶上的棉果。图片来源:克莱姆森大学-美国农业部合作推广幻灯片系列,美国[CC BY 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0)],通过Wikimedia Commons
A.棉叶上的棉果。图片来源:克莱姆森大学 - USDA合作推广滑轨系列,美国[CC 3.0(https://creativecommons.org/licenses/by/3.0)],通过维基共享资源

广泛的和重复使用的新烟碱类已经导致抗药性的发展中若干昆虫物种,包括,棉蚜,答:棉答:棉是一种广泛分布的害虫,影响西瓜、黄瓜、南瓜、棉花和柑橘等作物,是已知的最重要的经济农业害虫之一。噻虫嗪是一种新烟碱类杀虫剂,它能不可逆地结合到神经系统细胞的尼古丁乙酰胆碱受体(nAChRs)上,干扰昆虫神经冲动的传递[1]。

为进一步了解对噻虫嗪等新烟碱类药物的耐药机制,吴。最近研究了P450的转录物在噻虫嗪敏感和噻虫嗪抗性棉蚜株(2)表达的变化。九个P450基因在抗性菌株(尤其是CYP6CY14)中显著过表达。过表达的P450的参与通过经由人工饮食和dsRNA馈送导入的RNA干扰(RNAi)检查。

继续阅读《棉花蚜虫对噻虫嗪的抗性机理研究》

无细胞应用:龙的表征非编码转录RNA抑制

长非编码RNA已显示出调节染色质状态,转录活性和转录后活动(1)。只有少数研究发现长非编码RNA调控的平移过程(2)。非编码RNA BC200已经通过与翻译起始因子,eIF4A和EIF4B相互作用显示出抑制翻译。

为了表征BC200翻译抑制是如何被控制的,各种RNA的被转录/使用TNT系统(体外翻译猫。# L4610从Promega)。在每个转录/翻译反应中加入BC900 RNA、hnRNPE1和hnRNE2蛋白。当蛋白成功表达时,发现BC200活性受到抑制(3)。

文献引用

  1. Sosinska,P等人从细胞和分子角度卵巢癌(2015)腹膜内侵袭。Ginekol。波尔86,782 - 86。
  2. 盖斯勒,S。和科勒,J。(2013)意料之外的RNA:长链非编码RNA在不同的细胞环境中发挥作用Nat.Rev。摩尔。细胞。生物14日,699-12。
  3. 张成泽,S。等人。(2017)由核蛋白E1和E2 BC200 RNA介导的翻译抑制的调控。2月的信591,393 - 5。

多体分析的自动化方法

使用一套“组学”技术,你可以检查复杂的细胞过程在单一生物系统中跨所有分子结构域(例如,蛋白质组学、代谢组学、转录组学)一起工作的方式。在不同领域发表的一些研究说明了这种统一方法的力量(1,2)。然而,大多数研究并没有关注于开发一种高通量、统一的样品制备方法,以补充高通量“基因组学”分析。

最近的一份刊物古铁雷斯和他的同事们提出了一个简单的高通量过程(点)进行了优化提供高质量的标本进行代谢组学、蛋白质组学、转录组从一个共同的细胞培养样本(3),证明这种方法可以处理16−24样本细胞颗粒脱盐样本准备在9小时内质谱分析。他们还证明,与单独的样品制备方法相比,联合处理不会牺牲数据的质量。

文献引用

1.Roume, h (2013)从相同的唯一样代谢物,RNA,DNA和蛋白质的连续分离酶学方法531,219-236。
2.罗,A. W.et al。(2017)研究泌尿系致病性大肠杆菌毒力的“基因组学”方法。趋势Microbiol25,729-740。
3.古铁雷斯,D.。(2018)用于多体系统级分析的集成、高吞吐量策略j .蛋白质组Res

破伤风神经毒素:药物传递的潜在机制

破伤风神经毒素(的TeNT),所产破伤风梭菌是人类最强大的神经毒素之一。引起破伤风,其特征是疼痛的肌肉收缩和痉挛以及癫痫。帐篷由一条轻链和一条重链组成。TeNT的毒性特性存在于毒素轻链(L)中,但像完整TeNT一样,只有TeNT重链(TTH)和c端结构域(TTC)才能结合并进入神经元。

基于这些特性,最近考虑发布(1)TTC可能是一个有前途的车辆将药物输送货物到神经细胞。为了探究这种可能性,他们设计的含有各种的TeNT片段的融合蛋白。他们选择了B细胞白血病/淋巴瘤2蛋白(BCL-2)作为伙伴蛋白,因为Bcl-2的是最有效的抗凋亡蛋白之一,并且具有适当的尺寸(26kDa)作为融合配偶体。

他们测试了在两种细胞系和无细胞蛋白质表达系统中,这些融合蛋白,以确定纯化的融合产物是否保留既抗凋亡和神经元迁移的性质。一个构建体(Bcl2的-hTTC)显示出由血清和NGF剥夺诱导的神经元PC12细胞的神经元结合并阻止细胞死亡,通过从线粒体细胞色素C释放的抑制所证实。对于体内试验,Bcl2的-hTTC被注射到小鼠的舌片,观察到选择性迁移到细胞核舌下小鼠脑梗。

  1. Watanbe,Y.等人。(2018)破伤风毒素片段和Bcl-2融合蛋白:细胞保护作用和轴突逆行迁移。BMC生物技术18,39.

新重组的Asp-N质谱蛋白酶:改进的格式和降价

的Asp-N是天门冬氨酸残基的N末端侧的内切蛋白酶水解的肽键。天然形式分离自假单胞菌fragi。大多数厂商目前提供包括冻干材料为2μg的平底瓶一个商业产品,并为$ 175-200美国销售。在平底小瓶格式化的材料,例如少量可导致蛋白酶的不一致再悬浮。不一致的工作浓度,将导致不可重现的数据。目前的高价格也禁止大规模使用。

新的重组蛋白酶被克隆自Stenotrophomonas maltophilia并表示在大肠杆菌。与天然的aspn相比,重组的aspn具有相似的氨基酸裂解特异性。用天然和重组的Asp-N消化酵母提取物产生非常相似的结果。在v型小瓶中提供10毫升的冻干材料,并带有可见的饼状结构,可使再悬浮更加一致,从而产生可重复的数据。由于产量的提高,与天然酶相比,标价现在降低了大约40%。
了解更多关于这个新的重组Asp-N蛋白酶