提高你的转染成功率

12150558——plasmid_with_cell_membrane3并不是每一个实验室都有一个可以被所有实验室成员使用的可靠的转染协议。很少有研究人员会使用相同的细胞类型和相同的结构来生成数据。许多时候,科学家可能需要将不同的结构或甚至不同的分子(例如,短干扰RNA [siRNA])转染到同一细胞系中,或者在不同培养的细胞系中测试单个结构。一个结构可以很容易地转染到几个不同的细胞系中,或者一个转染协议可以对几个不同的结构起作用。然而,有些细胞如原代细胞很难转染,有些核酸需要优化才能成功转染。这里有一些技巧,这些技巧可以帮助你改善你的转染成功。

以一致的细胞密度转染健康、积极分裂的细胞。转染时细胞传代数应低,融合度为50-80%。使用相同的细胞密度可以减少复制的可变性。保持细胞支原体——以确保最佳生长。

使用高品质DNA转染。转染质量的DNA不含蛋白质、RNA和含A的化学物质260/一个2801.7 - -1.9的比例。在无菌水中或TE缓冲液中制备纯化DNA,最终浓度为0.2-1mg /ml。

优化用于转染细胞的DNA数量。根据使用的DNA类型和靶细胞系的不同,在转染中使用的DNA的最佳量会有很大的不同。我们建议最初DNA测试50 - 200 ng / 96孔板格式。增加DNA的数量并不一定会导致更高的转染效率。如果观察到,特别是在原代细胞中,降低DNA浓度可能有助于降低毒性。

优化转染试剂:DNA比对。对许多细胞系来说,转染试剂:DNA(微升试剂:微克DNA)的比例为1.5:1-4:1很好,但超过这个范围的比例可能对特定的细胞类型或应用是最理想的。测试其他比率,以最大限度地提高转染效率。使用带有报告基因的质粒(如萤火虫荧光素酶)可以监测转染效率。理想的报告基因产品是独特的细胞,可以表示从质粒DNA,可以化验方便。一般在转染24-48小时后进行。我们提供的FuGENE®HD优化分析工作表帮助确定最佳比例时,使用FuGENE®HD转染试剂

优化转染后每孔细胞数。特定细胞系的镀层密度将取决于生长速率。一般的做法是在5×10左右制版5贴壁细胞每60mm培养皿或10个6悬浮细胞测定。对于96孔板,我们一般建议1-2×104每孔贴壁细胞或2-10×105每孔悬浮细胞数。如果使用不同尺寸的板,按比例增加或减少细胞的数量。

确保所选择的转染试剂与含血清的培养基兼容,用于需要血清的细胞。许多转染方案需要无血清条件来达到最佳性能,因为血清会干扰许多商业上可用的转染试剂。但是,也有类似的试剂ViaFect™转染试剂可用于有血清存在的转染方案中,用于转染需要连续接触血清的细胞类型,如原代细胞培养物。

用转染试剂孵育DNA至最佳时间。许多转染试剂需要时间形成转染试剂:DNA复合物(例如,ViaFect™转染试剂在室温下5-20分钟)。不同细胞系形成复合物的最佳时间各不相同。转染细胞孵育24-48小时后进行检测,以便有时间观察转染DNA的表达。

不知道从哪里开始转染你的细胞系?的转染助理为转染提供了一个起点。只要选择一个细胞系和FuGENE®HD或FuGENE®6转染试剂就可以找到同行评议文献中使用的条件。的FuGENE®HD转染试剂协议数据库有转染你细胞系的协议选择细胞系、使用的平板类型和要转染的孔数,将根据Promega科学家测试的条件生成方案。

需要帮助转染优化?PubHub的文章"优化培养细胞的转染展示了如何建立和执行一个优化实验。

对转染还有疑问吗?我们的技术服务的科学家可以提供帮助。

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莎拉Klink

技术作家Promega公司
萨拉是土生土长的威斯康辛人,她在第五代奶牛场长大,12岁时就决定要成为一名科学家。她在威斯康星帕克赛德大学(University of Wisconsin-Parkside)接受教育,获得生物学学士学位和分子生物学硕士学位,之后在威斯康星麦迪逊大学(University of Wisconsin-Madison)获得肿瘤学硕士学位。她在Promega公司工作了超过15年,最初是作为一个技术服务科学家,目前作为一个技术作家。萨拉喜欢谈论她那群有趣的鸡,在规划她的春天花园时尽量不要太野心勃勃。

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