NanoLuc®荧光素酶:体内成像的光明前景

纳米uc活体成像

NanoLuc®荧光素酶技术的发展为研究人员提供了新的和更好的工具来研究内源性生物学:蛋白质如何在细胞和组织内的自然环境中表现。这种小的(约19kDa)荧光素酶,来源于深海虾Oplophorus gracilirostris,提供了若干优势萤火虫或Renilla荧光素酶。关于NanoLuc®荧光素酶的应用概述,请参见:NanoLuc®荧光素酶比报告基因检测更有效

NanoLuc®荧光素酶的小尺寸,以及缺乏ATP来产生生物发光信号,使其特别有吸引力的报告体内生物发光成像包括细胞和活体动物。作为融合蛋白的小报告分子的表达不太可能干扰目标蛋白的生物学功能。NanoLuc®二元技术(NanoBiT®)通过创建一个互补报告系统(其中一个亚基只有11个氨基酸长度)将这一方法更进一步。本视频解释了高亲和力的NanoBiT®互补(HiBiT)的工作原理:

追踪病毒的小标签

基于NanoLuc®体内成像的早期应用是病毒感染的研究。在2013年,Tran等人。报告复制能力的记者病毒的流感A(1)的小鼠模型研究的发展。以前生物发光成像技术通常导致在是不稳定的和从体内有限的灵敏度受到记者病毒。该NanoLuc®记者病毒,这是等同于天然的A型流感病毒小鼠表现出致病性和杀伤力。使用记者病毒,研究人员能够跟踪在肺部的病毒载量和传播。他们的研究结果证明在研究新出现的病毒和抗病毒治疗的潜在影响NanoLuc®记者病毒的工具。

最近的一项研究证实了一种构建报告病毒的方法,该方法进一步提高了报告病毒的稳定性,并在设计报告病毒时提供了更大的灵活性(2)。在本研究中,研究人员将HiBiT标记插入修饰过的溶瘤腺病毒基因组中,在病毒E3启动子的控制下。该启动子在感染后不久被病毒E1A蛋白激活。为了证明报告病毒的稳定性和功能,研究人员感染了表达互补LgBiT肽的贴壁和悬浮前列腺癌细胞株。他们观察到NanoBiT®荧光素酶活性在所有被测细胞系感染24小时后,使用Nano-Glo®底物成功重构。

在体内成像方面,他们监测了报告病毒对lgbit表达细胞的稳定感染,然后用报告病毒或对照组植入小鼠体内感染肿瘤。腹腔内(IP)底物管理显示成功的感染和良好的底物分布,导致持续的生物发光发射。研究人员在这些实验中使用了呋喃马嗪的衍生物(氢呋喃马嗪),因为它增加了溶解度,并且在成像所需的浓度下,可以很容易地给药。这个衬底,连同fluorofurimazine-which提供更加美好的体内信号最近在老鼠体内成像应用开发(3)。这些小说基质为推进体内研究打开新的选项NanoLuc®记者技术。

结果表明,溶瘤病毒没有达到整个肿瘤集体感染动力学(2)的进一步研究;然而,这个结果与临床试验的溶瘤腺病毒的研究结果一致。作者认为,他们的做法是适用于研究范围广泛的病毒,特别是那些无法耐受大的转基因插入。

更好地与BRET:抗体 - 受体相互作用

使用生物发光实体瘤或其它组织的成像的一个挑战是生物发光反应的发射波长。血红蛋白吸收主要在可见光谱的蓝色和绿色的区域;因此,理想的生物发光反应将发射在远红外区域(4)的光。NanoLuc®荧光素酶反应在460nm发射光,在蓝色区域。与合适的发射波长的荧光染料传统上已被用于体内成像,但按要求对外部激发源是有限的。

生物发光共振能量转移(BRET)提供了最好的两个世界:小尺寸的NanoLuc®荧光素酶标签和亮度的荧光分子。在BRET中,当供体荧光素酶底物与荧光受体分子接近时,能量就会从底物转移到荧光受体分子上。然后荧光分子以自己的最佳波长重新发出光。由于NanoLuc®荧光素酶不依赖atp,它也可用于BRET应用,报告基因在细胞外表达,为研究发生在细胞表面的分子相互作用创造了新的可能性。

Tang等人使用BRET研究治疗性抗体与活体动物受体的结合(5)。他们将NanoLuc®荧光素酶融合到表皮生长因子受体(EGFR)的n -端,并使用与治疗性抗体西妥昔单抗共价结合的荧光染料DY605作为受体。当将呋喃马嗪单独添加到NanoLuc®-EGFR融合蛋白时,在460nm处产生了预期的发射峰,而抗体结合则在625nm处产生了额外的发射峰。这两个发射峰的分离足够可靠和灵敏的检测,在细胞培养的特征。

在体内实验中,研究人员使用裸鼠肿瘤移植模型检查了西妥昔单抗的受体占用和药代动力学。他们观察到受体不完全占用,即使是在高于西妥昔单抗治疗剂量的情况下,这表明只有一小部分受体可用于抗体结合。尽管存在一些技术上的限制,BRET被证明是一种有用的、无创的成像技术来建立西妥昔单抗与EGFR结合的剂量-反应关系。作者指出,该方法可以推广到研究其他治疗性抗体的疗效和毒性。

一种替代BRET的方法是融合生物发光蛋白和荧光蛋白。例如Antares报告系统的开发,在该系统中,NanoLuc®荧光素酶被融合到两个拷贝的可激发的橙色荧光蛋白1 (Cy-OFP1)。这一方法概述于使BRET成为体内成像的明亮选择:使用纳米uc®荧光素酶和荧光蛋白受体。Su等人(3)使用Antares报告器和萤火虫荧光素酶报告器对小鼠的两个细胞群进行体内成像。他们能够测量肿瘤大小,也能在同一只动物中观察嵌合抗原受体(CAR) t细胞迁移。

更多关于NanoLuc®荧光素酶的体内成像应用,或查询新的检测方案,请参阅我们的NanoLuc®生物荧光成像资源页面。

参考

  1. 陈德良,五等。(2013)高度敏感的实时体内流感病毒的记者成像揭示了复制和传播的动态。病毒学杂志87,13321。
  2. Gaspar, N.等人(2020)纳米系统和氢呋喃马嗪优化小鼠病毒感染检测-一种新的体内成像平台。Int J. Mol. Sci21,5863。
  3. 苏,Y。等。(2020)新的NanoLuc基板能够在动物亮两人口生物发光成像。Nat方法。17, 852 - 860。
  4. 赵,H.等。(2005)的生物发光记者和与哺乳动物组织的相互作用的发射光谱确定检测体内的灵敏度。j .生物医学。光学10 (4), 041210年。
  5. Tang, Y. et al.(2019)一种基于生物发光共振能量转移的测定体内抗体受体占用率的方法。iScience15, 439 - 451。

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Ken是Promega公司的科学作家。虽然他的博士学位是分子生物学,但他喜欢研究和写作从m理论到笔石的所有东西。当他没有时间和家人在一起或服务他的狗和猫的统治者,肯从事一种神秘的生物被称为“空闲时间”。如果他成功了,他希望重新开始写小说,这样他的大脑就能保持平衡。

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