rna -蛋白质相互作用:药物发现的新前沿

几乎90%的人类基因组被转录成RNA,但只有3%最终转化为蛋白质。一些非翻译的RNA被认为是无用的,而有些人在癌症和其他疾病中起着显着的作用。尽管其丰富和生物意义,RNA很少是治疗剂的目标。

“我们说这是不可驾命的,但我会说”尚未吸毒“是一个更好的方式,”密歇根大学药用化学副教授阿曼达加纳说。“我们知道RNA生物学很重要,但我们还不知道如何瞄准它。”

Amanda的实验室开发系统学习RNA生物学。她采用各种方法来分析不同RNA的功能,并研究其与蛋白质的相互作用。她的实验最近发表了一个描述活细胞中RNA-蛋白质相互作用(RPI)的新方法。阿曼达说,通过合适的工具,RPI可能成为药物发现的关键目标。

“目前的药物有史以来,这是令人惊讶的,因为他们都是基于真正古老的方法,”阿曼达说。“这不会像开发小分子激酶抑制剂一样。这是一个全新的世界。“

RNA:一个棘手的目标

分子生物学的中央教条是大多数大学级生物课程中教授的第一件事之一。DNA被转录成RNA,将其翻译成蛋白质。虽然中央教条捕获了细胞从核酸到蛋白质的基本原理,但它未能捕获RNA在人体生物学中发挥的复杂作用。虽然一些RNA如信使RNA(mRNA)被翻译成蛋白质,但绝大多数不是。

非编码RNA(NCRNA)负责调节转录,剪接和翻译。这些分子包括长期非编码RNA(LNCRNA),MicroRNA(miRNA),小干扰RNA(siRNA)和许多其他。某些类型的NCRNA涉及许多疾病,包括代谢,遗传和神经变性。例如,MicroRNA(miRNA)失呼算法,有助于癌症生长和进展。

不幸的是,众所周知,RNA很难研究。它通常非常小——阿曼达的实验室一直在研究的miRNAs大约有22个核苷酸长。RNA被分离出来后很容易降解,而且经常容易受到污染。在药物发现方面,与蛋白质相比,要确定RNA的结构要困难得多。

“我们认为它就像一个改变了许多不同的结构的意大利面条,”阿曼达说。“我们认为蛋白质是静态 - 这是我的水晶结构,我有这个美丽的口袋。由于其灵活性,RNA不能像那样结晶。“

有一些结构化的RNA,Amanda表示,低温电子显微镜(Cryo-EM)可能会阐明这些结构中的一些结构。但是,即使发现了结构性的RNA,研究它们也会出现新的挑战。在溶液中分离RNA的生物化学方法可能因结构变化或缺乏细胞内Milieu而导致溶液中的RNA中的RNA可能无法重新承载真正的生物学。为了解决这一挑战,Amanda的实验室需要一种查看Live Cells中的RNA。

RIPCA:靶向活细胞中的RNA-蛋白质相互作用

与蛋白质介导的互补测定或RIPCA的RNA相互作用是用于检测RBP与miRNA之间的相互作用的概念验证系统。测定使用嗜烟丸和纳米酚,并表达化学发光信号以指示RPI。HaloTag (HT)是一种蛋白质融合标签,其形成具有许多不同配体的高度特异性的共价键。纳米牛这是一个基于NanoLuc®Luciferase的双亚基系统,其中SmBiT和LgBiT两个亚基已经经过优化,以实现最小的自结合。

RIPCA由Amanda的两个学生,Daniel Lorenz和Sydney Rosenblum设计和测试。实验室以前与称为催化酶连接的咔哒化学测定或CAT-ELCCA的测定的实验室合并,组合使用ELISA启发方法,以实现靶向RPI的分子的高通量筛选。然而,Cat-Elcca是劳动密集型和资源的饮用,它只看过解决方案中的RPI。丹尼尔提出了一种新的测定,可以检查活细胞中的RPI。

“基本上,他是一名化学生物学毕业生,了解每一块酷炫的化学生物技术,”丹尼尔说,阿曼达说。“他就像一个疯狂的科学家,问'如果我们把所有这些东西一起把所有这些都在一起吗?”当他想出这个测定时,我看到它很漂亮,随着很多转染。所有这些东西都必须融合它来工作。但我说'让我们试试吧。“

RIPCA的示意图,由Amanda Garner的实验室设计的系统,以研究活细胞中的RNA-蛋白质相互作用。
RIPCA的示意图,由Amanda Garner的实验室设计的系统,以研究活细胞中的RNA-蛋白质相互作用。

RIPCA系统从表达SMBIT-HT的单元线开始。接下来将细胞用含有Lgbit融合的RBP的质粒转染,以及含有聚乙烯化氯烯烃基序的RNA探针。在细胞中,氯烷烃手柄首先与卤橡胶结合。如果RNA探针然后与RBP结合,则将中SMBit和Lgbit结合在一起以重新组装功能型Nanoluctucth荧光素酶蛋白。然后用荧光素酶底物处理细胞,发光信号表明RNA和RBP之间的成功相互作用。在他们的最近的文章RSC化学生物学Amanda的实验室表明,RiPCA可以选择性地检测pre-miRNA pre-let-7与其结合伙伴Lin28之间的相互作用。

“我们现在将它同时将其应用于许多其他系统,包括Mirnas以外的RNA,”Amanda说。“我们只是将它小型为384洞。我们正在努力做一个小分子屏幕,实际看看这是否会使Bet-7和Lin28产生生物活性靶向化合物。“

针对药物开发中的RNA

Garner实验室对发现RNA和RBPS之间的交互并不感兴趣。阿曼达表示,他们最大的目标是找到可用于治疗研究的RPI。

“最终,我们想找到一种具有某种功能效果的分子。我们并不真正关心它是否靶向RNA或RNA结合蛋白,因为我们故意采取了更广泛的观点。也许Let-7没有足够的结构复杂性,我们将获得一个非常特定的化合物。也许经过RNA结合蛋白更好。并且可能有RPI,我们不能用小分子靶向,但这并不意味着它不能瞄准生物学。“

Amanda希望她的实验室通过采用多种多样的方法来开拓RNA研究的新领域。她鼓励其他实验室使用他们的分析方法,包括RiPCA系统,她希望看到她的研究被用于生物技术和制药。

“文献中没有许多验证的RNA结合蛋白质相互作用。我认为越来越多的工作进入了这一点,有一个被证明适用于许多系统的测定,希望能够在这些RNA蛋白质相互作用之后能够实现这一全新领域,“她说。

Amanda承认,她的实验室的研究和方法的广度可能会为没有期望看到RNA分析,蛋白质组学和高通量筛查的新学生来说是压倒性的。然而,她认为,开放的心态和对未来的关注对于回答在她的领域仍然开放的无数问题至关重要。

“有时候你会想,‘天哪,我们为什么要参与这些事情?’”她说。“但这就是科学对我的意义。这一切都是关于发现和思考下一个问题。我们阅读了分子生物学教科书,认为我们已经找到了答案,但我们应用的新技术和现代方法越多,我们就越意识到这可能不会真的发生。”


查看Amanda最近出版物的Halotag®和Nanobit®在Lahotag®和Nanobit®中检测活细胞中的RNA-蛋白质相互作用的全部方法RSC化学生物学

Rosenblum,S.L..(2021)用于检测microrna -蛋白相互作用的活细胞实验。RSC化学生物学2,241-7。


Nanoluc®Luciferase和Halotag®技术在研究RNA蛋白质相互作用之外具有广泛的应用。在这些最近的博客文章中了解更多内容:

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Jordan Villanueva在2017年加入Promega之前研究了西北大学的书写和生物学。作为一个科学作家,他对科学的人类最感兴趣 - 这些故事和人们背后的文章背后的人。研究兴趣包括免疫学和神经科学,以及Covid-19大流行。当他没有工作时,约旦喜欢转向酵母烘焙进入科学。这只是一种酵母和乳酸菌的共生文化,右图?

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