RNA蛋白质相互作用:一种用于药物发现的新前沿

几乎90%的人类基因组被转录成RNA,但只有3%最终被翻译成蛋白质。一些非翻译RNA被认为是无用的,而一些在癌症和其他疾病中发挥着重要但通常神秘的作用。尽管RNA丰富且具有生物学意义,但它很少成为治疗的目标。

“我们说这是不可驾命的,但我会说”尚未吸毒“是一个更好的方式,”密歇根大学药用化学副教授阿曼达加纳说。“我们知道RNA生物学很重要,但我们还不知道如何瞄准它。”

Amanda的实验室开发系统学习RNA生物学。她采用各种方法来分析不同RNA的功能,并研究其与蛋白质的相互作用。她的实验最近发表了一个描述活细胞中RNA-蛋白质相互作用(RPI)的新方法。阿曼达说,通过合适的工具,RPI可能成为药物发现的关键目标。

“目前的药物有史以来,这是令人惊讶的,因为他们都是基于真正古老的方法,”阿曼达说。“这不会像开发小分子激酶抑制剂一样。这是一个全新的世界。“

一个棘手的目标

分子生物学的核心教义是大多数大学水平的生物学课程最先教授的内容之一。DNA被转录成RNA, RNA被翻译成蛋白质。虽然核心信条掌握了细胞如何从核酸转化为蛋白质的基本原理,但它未能掌握RNA在人类生物学中扮演的复杂角色。虽然有些RNA(如信使RNA (mRNA))可以翻译成蛋白质,但绝大多数却不能。

非编码RNA(NCRNA)负责调节转录,剪接和翻译。这些分子包括长期非编码RNA(LNCRNA),MicroRNA(miRNA),小干扰RNA(siRNA)和许多其他。某些类型的NCRNA涉及许多疾病,包括代谢,遗传和神经变性。例如,MicroRNA(miRNA)失呼算法,有助于癌症的生长和发展。

不幸的是,RNA难以研究。它经常令人难以置信的小 - 阿曼达的实验室已经学习的miRNA是大约22个核苷酸。RNA在隔离物时容易降解,通常易受污染的影响。在药物发现的背景下,与蛋白质相比,确定RNA的结构更难。

“我们认为它就像一个改变了许多不同的结构的意大利面条,”阿曼达说。“我们认为蛋白质是静态 - 这是我的水晶结构,我有这个美丽的口袋。由于其灵活性,RNA不能像那样结晶。“

有一些结构化的RNA,Amanda表示,低温电子显微镜(Cryo-EM)可能会阐明这些结构中的一些结构。但是,即使发现了结构性的RNA,研究它们也会出现新的挑战。在溶液中分离RNA的生物化学方法可能因结构变化或缺乏细胞内Milieu而导致溶液中的RNA中的RNA可能无法重新承载真正的生物学。为了解决这一挑战,Amanda的实验室需要一种查看Live Cells中的RNA。

RIPCA:靶向活细胞中的RNA-蛋白质相互作用

与蛋白质介导的互补测定或RIPCA的RNA相互作用是用于检测RBP与miRNA之间的相互作用的概念验证系统。测定使用嗜烟丸和纳米酚,并表达化学发光信号以指示RPI。哈托格(HT)是一种蛋白质融合标签,与许多不同的配体形成高度特异的共价键。纳米牛是一种基于Nanoluc®荧光素酶的双子单元系统,其中已经针对最小的自我关联进行了优化了两个亚基,SMBit和LGBit。

RIPCA由Amanda的两个学生,Daniel Lorenz和Sydney Rosenblum设计和测试。实验室以前与称为催化酶连接的咔哒化学测定或CAT-ELCCA的测定的实验室合并,组合使用ELISA启发方法,以实现靶向RPI的分子的高通量筛选。然而,Cat-Elcca是劳动密集型和资源的饮用,它只看过解决方案中的RPI。丹尼尔提出了一种新的测定,可以检查活细胞中的RPI。

“基本上,他是一个化学生物学研究生,知道每一个很酷的化学生物技术,”阿曼达这样评价丹尼尔。“他就像一个疯狂的科学家,问‘如果我们把所有这些东西拼凑在一起会怎么样?’”“当他提出这个实验时,我发现它非常复杂,需要进行大量的转染。所有这些都必须结合在一起才能起作用。但我说‘让我们试试吧。’”

RIPCA的示意图,由Amanda Garner的实验室设计的系统,以研究活细胞中的RNA-蛋白质相互作用。
这是由Amanda Garner的实验室设计的用于研究活细胞中rna -蛋白质相互作用的系统。

RiPCA系统从一个表达SmBiT-HT的细胞系开始。接下来用含有RBP和LgBiT融合的质粒以及含有聚乙二醇化氯烷基基链的RNA探针转染细胞。在单元中,氯烷烃的把手首先与卤化物标签结合。如果RNA探针与RBP结合,SmBiT和LgBiT将聚集在一起,重新组装一个功能性NanoLuc®荧光素酶蛋白。然后用荧光素酶底物处理细胞,发光信号表明RNA和RBP之间成功相互作用。在他们的最近的文章RSC化学生物学,Amanda的实验室表明RIPCA可以选择性地检测前miRNA预先置于Let-7之间的相互作用Lin28。

“我们现在将它同时将其应用于许多其他系统,包括Mirnas以外的RNA,”Amanda说。“我们只是将它小型为384洞。我们正在努力做一个小分子屏幕,实际看看这是否会使Bet-7和Lin28产生生物活性靶向化合物。“

针对药物开发中的RNA

Garner实验室对发现RNA和RBPS之间的交互并不感兴趣。阿曼达表示,他们最大的目标是找到可用于治疗研究的RPI。

“最终,我们想找到一种具有某种功能效果的分子。我们并不真正关心它是否靶向RNA或RNA结合蛋白,因为我们故意采取了更广泛的观点。也许Let-7没有足够的结构复杂性,我们将获得一个非常特定的化合物。也许经过RNA结合蛋白更好。并且可能有RPI,我们不能用小分子靶向,但这并不意味着它不能瞄准生物学。“

通过采取多种方法,阿曼达希望她的实验室可以在RNA研究中开辟新的前沿。她鼓励其他实验室使用他们的分析,包括RIPCA系统,她希望看到她在生物技术和药品中使用的研究。

“文献中没有许多验证的RNA结合蛋白质相互作用。我认为越来越多的工作进入了这一点,有一个被证明适用于许多系统的测定,希望能够在这些RNA蛋白质相互作用之后能够实现这一全新领域,“她说。

Amanda承认,她的实验室的研究和方法的广度可能会为没有期望看到RNA分析,蛋白质组学和高通量筛查的新学生来说是压倒性的。然而,她认为,开放的心态和对未来的关注对于回答在她的领域仍然开放的无数问题至关重要。

“有些日子你就像'哦上帝,为什么我们陷入所有这些东西?”“她说。“但这就是科学对我来说。这完全是关于发现和思考下一个问题。我们读了我们的分子生物学教科书,并认为我们已经弄清楚了,但我们越多,我们越多的技术和现代方法,我们就越意识到它可能并不是那种方式。“


查看Amanda最近出版物的Halotag®和Nanobit®在Lahotag®和Nanobit®中检测活细胞中的RNA-蛋白质相互作用的全部方法RSC化学生物学

Rosenblum,S.L.。(2021)用于检测前微小RORNα-蛋白质相互作用的活细胞测定。RSC化学生物学2,241-7。


Nanoluc®Luciferase和Halotag®技术在研究RNA蛋白质相互作用之外具有广泛的应用。在这些最近的博客文章中了解更多内容:

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Jordan Villanueva在2017年加入Promega之前研究了西北大学的书写和生物学。作为一个科学作家,他对科学的人类最感兴趣 - 这些故事和人们背后的文章背后的人。研究兴趣包括免疫学和神经科学,以及Covid-19大流行。当他没有工作时,约旦喜欢转向酵母烘焙进入科学。这只是一种酵母和乳酸菌的共生文化,右图?

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