回首:无细胞表达系统有助于在缺氧反应涉及特征分析蛋白质

的HIF-1α-VHL蛋白-ElonginB-ElonginC复杂Structur
一个HIF-1α-VHL蛋白-ElonginB-ElonginC复杂的结构

威廉·G·凯林小,彼得·拉特克利夫爵士和格雷格L. Semenza的被授予了2019年诺贝尔生理或医学他们的细胞如何感知和适应氧气供应发现。

凯林和拉特克利夫的实验室集中讨论了转录因子HIF(缺氧诱导因子)的努力。这个转录因子在细胞适应关键的对氧气供应的变化。

当氧气水平升高的细胞含有非常少的HIF。泛素被添加到经由VHL复合物中的蛋白HIF并且其在蛋白酶体中降解。当氧气水平低(缺氧)的HIF的量增加。

在2001年这两个群体发表的文章表征VHL和HIF之间的相互作用,以及这些文章是由诺贝尔奖组织中引用它们的新闻稿今年的奖项。(1,2)。这两项研究都表明,脯氨酸的正常氧条件下的羟基化残基P564启用VHL识别和结合到HIF。

使用无细胞表达的(即,TNT偶联的转录/翻译系统)由两个实验室是在VHL的表征键:HIF相互作用的实验室使用HIF和VHL35-S下正常或处于缺氧工作站经由TNT系统产生的标记的蛋白质:

  • 确定的氯化亚铁和氯化钴的相互作用的影响
  • 映射到发生所需的相互作用HIF的特定区域(556-574)
  • 确定HIF点突变对相互作用的影响
  • 使用合成肽阻止的相互作用
  • 得出结论,对于要发生的相互作用在哺乳动物细胞中的一个因素是必要的。

参考文献

  1. 伊万,男。(2001)HIF通过脯氨酸羟基化针对VHL介导的破坏:对Ø2传感科学292:464-67。
  2. Jaakkola,P.等。(2001年)HIF-α的靶向的复杂的希佩尔 - 林道泛素化被O2- 脯氨酰监管羟化科学202,468-72。

相关文章

无细胞应用:蛋白质阵列(核酸可编程)

产生蛋白质阵列的传统方法需要数百蛋白的单独的表达,然后纯化和蛋白质的固定化在固体表面上。无细胞蛋白质阵列技术通过从他们的DNA模板的体外合成的靶蛋白的产生进行蛋白质微阵列。
对于无细胞基于微阵列的生成的一种方法是将核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)。

NAPPA使用了被生物素化,并绑定到抗生物素蛋白被预涂覆到蛋白质捕获表面的DNA模板。其具有标记GST新合成的蛋白质,然后通过结合到相邻的多克隆抗GST捕获抗体固定化的旁边的模板DNA。下面引用说明使用NAPPA的屏幕数百蛋白质。继续阅读“无细胞应用:蛋白质阵列(核酸可编程)”